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相差显微镜概述
2016-08-08
相差显微镜由P·Zernike(采尔尼克)于1932年发明,并因此获1953年诺贝尔物理学奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。我们知道,人眼只能区分光波的波长(颜色)和振幅(亮度),对于无色透明的生物标本,当光线通过时,波长和振幅变化不大,在明场观察时很难观察到标本。

相差显微镜的基本原理是:把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射,偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅增大或减小,提高反差。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处:

1、环形光阑(annular diaphragm):位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。

2、相位板(annular phase plate):在物镜中加了镀有特殊膜层(如氟化镁、硫化锌与铬等)的相位板,可将直射光在规定的区域内通过,且被吸收掉大量的光能量,使直射光的振幅衰减至与衍射光振幅相当,同时改变某一个位相差,分为两种:

(1)A+相板:将衍射光的相位推迟1/4λ(90°),两组光波合轴后光波相加,振幅加大,当标本折射率大于周围介质时,标本图像比背景暗,反之,标本图像比背景图像亮。此时,相板环形部分仅起吸收直射光能量的作用,其余通光部分则起改变相位的作用(即改变衍射光的相位)。

(2)B+相板:将直射光推迟1/4λ(90°),两组光线合轴后光波相减,振幅变小,当标本折射率大于周围介质时,标本图像比背景亮,反之,标本图像比背景图像暗。同A+相板相比,主要是通过改变直射区域的膜层厚度来实现透射率与相位的改变,此时相板环形部分不仅起吸收直射光能量的作用,还改变直射光相位。

应用相衬显微镜要注意以下几个方面:

A.光源要强,全部开启孔径光阑;

B.使用滤色片,使光波近于单色。

相衬显微镜与暗视野显微镜均可以观察未染色的透明样品,但其成像照明原理是完全不同的,同后续的微分干涉观察法也有着本质的区别。 

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